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蛋白多肽類藥物長效化技術研究進展

2019-04-29    來源:    作者:  瀏覽次數:495

近年來,蛋白多肽類藥物因在治療疾病方面具有顯著的優點,普遍受到研究者的青睞;另一方面,蛋白多肽類藥物半衰期一般較短,影響患者用藥順應性。結合蛋白多肽類藥物藥動學特點,總結蛋白多肽類藥物長效化方法的研究進展,主要包括氨基酸替代、定點修飾突變、通過基因手段與其他蛋白融合、糖基化、環化、與聚合物綴合、釘合肽,以及新劑型開發等方法,希望能對藥物研發工作者有所幫助。

蛋白多肽類藥物毒性小、特異性強,針對某些疾病的藥理活性較好,在藥物開發中被認為是十分有前途的生物大分子,但此類藥物穩定性較低、易被體內各種酶降解以及腎清除迅速,導致其半衰期較短,從而限制了藥物的使用。因此,開展蛋白多肽類藥物長效化相關研究十分重要,延長其血漿半衰期的策略不僅可以改善既定藥物的藥動學特性,也可能為藥物使用開發新的適應證。本文基于蛋白多肽類藥物藥動學特點,綜述了蛋白多肽類藥物長效化技術的研究進展。

1 蛋白多肽類藥物藥動學特點

1.1    吸收

蛋白多肽類藥物因相對分子質量的不同,其吸收方式也存在一定差異。通常,小肽的吸收方式包括載體轉運和被動擴散;大分子蛋白多肽的吸收方式包括膜脂擴散以及細胞間隙擴散;高度親脂性藥物則能通過淋巴途徑吸收進入體內。由于胃腸道蛋白降解酶對于蛋白多肽類藥物降解作用的影響,此類藥物口服給藥生物利用度較低,多數都優先選擇注射給藥,但也因此影響了患者的用藥順應性。研究者一直致力于開發適合蛋白多肽藥物的非注射給藥途徑,目前有望通過納米技術克服這一瓶頸。除了聯合給藥及對藥物進行改造,目前還開發了多種技術模型來研究及預測蛋白多肽類藥物在體內的腸道吸收及其體內生物利用度。皮下注射是蛋白多肽藥物重要的給藥途徑,此種給藥方式吸收過程較為緩慢,能維持藥物在體內穩定的效應,并且可以避開肝首過效應,降低藥物的給藥劑量。

1.2    分布

蛋白多肽類藥物在體內的分布主要由擴散和較小程度的對流外滲組合驅動,分布體積通常不大于細胞外體液的體積。另外,此類藥物體內分布具有明顯的靶向性,根據此特點可開發靶向給藥,使藥物能夠快速到達病灶部位發揮藥物療效。 Han 等利用丙氨酰-谷氨酰-酪氨酰-亮氨酰-精氨酸序列(AEYLR)作為體外靶向表皮生長因子受體(EGFR)的小肽配體,研究了AEYLR 和 AEYLR 共軛納米結構脂質載體(NLC)的體內靶向性。結果表明,AEYLR 修飾的 NLC 是有希望用于聯合癌癥化學療法的靶向遞送系統,不僅能提高治療效果,也能減少毒副作用。研究人員對切割人血清白蛋白得到的白蛋白片段進行光學成像研究,發現其可選擇性地積聚在腎臟中,可作為腎靶向的預期載體。精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸序列(RGD)與包封有熒光染料吲哚菁綠( ICG)的聚乙二醇( PEG)化脂質體的綴合物,可作為一種有效的遞送系統靶向胃癌細胞中高表達的整合素受體。

1.3    代謝和消除

血液、肝臟、腎臟和小腸中含有各種蛋白酶和肽酶,是蛋白多肽類藥物發生降解的主要部位。除此之外,因蛋白酶和肽酶也存在于全身其他部位,此類藥物的代謝并不限于經典的消除器官,大多數半衰期短的多肽主要經過肽酶快速水解被消除。通常,相對分子質量較小的多肽可以通過腎臟中的腎小球自由過濾,然后在近端小管細胞的刷狀緣膜中水解降解。理論研究和臨床數據表明,對于蛋白類治療劑,腎臟可在一定程度上調節這些物質的功效或安全性,并在分解代謝中發揮相關作用。若機體對蛋白水解具有抗性,則主要通過腎臟消除。例如,艾塞那肽是胰高血糖素樣肽-1( GLP-1)模擬物,含有 39 個氨基酸,氨基酸取代使艾塞那肽對二肽基肽酶-4 的降解產生抗性,因此艾塞那肽經腎小球濾過后在腎小管中酶促降解。

肝臟代謝可能主要對一些小肽藥物的代謝消除具有實質性作用,例如用于治療多發性骨髓瘤的二肽硼替佐米會經歷廣泛的氧化性肝代謝,但若機體肝功能發生損傷,則清除率會降低。類似地,環狀十一肽環孢素通過被動擴散進入肝細胞,幾乎完全經過肝臟代謝消除。

蛋白多肽類藥物還具有非線性藥動學特征:大部分藥物與藥理學靶標高度結合,隨后消除藥物-靶標復合物,由于受體的數量有限,會出現劑量依賴性非線性藥動學,如血小板生成素模擬肽靶向介導藥物的處置過程顯示出明顯的劑量依賴性。

2 改善蛋白多肽類藥物半衰期的方式

天然的蛋白多肽類藥物通常具有較差的吸收、分布、代謝和排泄特性,如半衰期短、滲透性低,有時溶解度也較低 [14]。為了更加充分地發揮藥物的治療效果,提高患者的耐受性,目前已經開發出多種改善蛋白多肽類藥物穩定性的策略,延長體內半衰期,使其長效化。

2.1    氨基酸替代

蛋白多肽類藥物含有的某些代謝不穩定的氨基酸,會極大地影響藥物的半衰期,因此取代這類代謝不穩定的氨基酸是延長藥物半衰期的一種方式。生長抑素是一種多肽類藥物,含有14個氨基酸,其體內半衰期非常短,只有2 ~ 3 min,研究發現,通過將第8位的D-色氨酸用L-色氨酸取代可以增加作用時間,延長其體內半衰期。

除一般氨基酸取代策略,將非天然氨基酸引進蛋白多肽類藥物中也可以增加此類藥物的穩定性、延長半衰期,目前已研究出多種將非天然氨基酸引入蛋白多肽中的方法。促性腺素釋放激素(GnRH)本身的血漿半衰期非常短,而合成的十肽 GnRH 拮抗劑(西曲瑞克、地加瑞克、阿巴瑞克)和 GnRH 激動劑(曲普瑞林、亮丙瑞林、布舍瑞林、戈舍瑞林、那法瑞林)均含有非天然氨基酸,與 GnRH 相比均表現出延長的半衰期。同時,引入非天然氨基酸還可提高肽的親和力。目前,已有多種治療性多肽通過氨基酸替代有效延長了體內半衰期(見表 1)。

非天然氨基酸取代策略的一個主要問題是非天然氨基酸的潛在毒性。例如,具有非天然氨基酸取代的GnRH 類似物與患者的藥物不良反應相關。另有研究發現,非天然氨基酸會在肝臟及其他器官中積聚。

2.2    定點修飾突變

突變蛋白分子的特定位點,也能夠改善其穩定性并延長蛋白多肽類藥物的血漿半衰期。如人胰島素,將A 鏈第 21 位的天冬氨酸突變為甘氨酸,在 B 鏈 C 端第 30 位加入 2 個精氨酸,得到的突變體在體內能持續釋放且血藥濃度保持恒定,長達 24 h?怪屏鏊 M( OSM)是一種相對分子質量為 28 000 的可溶性細胞因子,由活化的免疫細胞分泌,越來越多的證據表明,OSM 在炎癥中起著關鍵作用。 CNTO 8212 是抗 OSMIgG1 單克隆抗體 Fc 區突變體,藥動學研究結果顯示,CNTO 8212 具有較低的全身清除率和較長的食蟹猴體內終末半衰期,預測的人藥動學參數提示 CNTO 8212可在臨床中以較低頻率給藥。

2.3    通過基因手段與其他蛋白融合

融合蛋白與蛋白多肽類藥物基因融合表達,能夠增加藥物的相對分子質量,降低體內腎清除率,可達到延長藥物體內半衰期的目的。FcIII 是一種 13-mer IgGFc 結構域結合肽(IgGBP),通過融合蛋白結合血清IgG 來增加蛋白質的體內半衰期,其與未融合修飾的蛋白質相比,半衰期增加了 75 倍。 IgG1 Fc 片段非糖基化單鏈與干擾素-α( IFN-α)融合后得到 IFN-α/FcMD,與商業聚乙二醇化 IFN-α(PEG-IFN-α)進行比較,IFN-α/Fc-MD 顯示出與 PEG-IFN-α 相當的抗病毒活性。體內藥動學測定顯示, IFN-α/Fc-MD 在 SD 大鼠中具有比 PEG-IFN-α 更長的半衰期。水蛭素與白蛋白融合后,藥物體內作用時間延長,且其生物學活性也得到增強。艾塞那肽被廣泛用于治療 2 型糖尿病,將艾塞那肽與人血清白蛋白( HSA)結合得到的融合肽顯示出與天然艾塞那肽類似的促胰島素分泌活性。皮下給藥后艾塞那肽-HSA 的藥動學分析顯示,其與艾塞那肽相比,血漿半衰期延長了 4 倍。此外,艾塞那肽 -HSA 在口服葡糖糖耐量試驗中顯示出顯著改善的抗高血糖作用且增強了降血糖作用 [27]。通過基因融合技術提高蛋白多肽類藥物穩定性,是目前蛋白多肽類藥物長效化的良好途徑,其中不少融合蛋白藥物已經被批準上市(見表 2),同時也有相當多的融合蛋白藥物處于臨床在研階段(見表 3)。

2.4    糖基化

糖基化通常發生在核酸、蛋白質和脂質等大分子中,在炎癥、免疫反應和細胞內轉運等生物過程中發揮著重要作用。許多治療性蛋白多肽類藥物在體外進行糖基化后,其藥動學和藥效學特性可獲得改善,此外,使用酶促或化學綴合方法的聚糖修飾還可促進蛋白質靶向疾病影響的組織。研究發現,對重組 α-1 抗胰蛋白酶(rA1AT)柔性 N-末端區域進行 N-糖基化修飾后,增加了 rA1AT 的循環半衰期,同時未改變其蛋白酶抑制活性。特異性血管活性腸多肽受體 2 激動劑( BAY55-9837)作為 2 型糖尿病的潛在蛋白質治療劑,穩定性較差,體內半衰期較短,而將其與殼聚糖修飾的硒納米顆粒( CS-SeNP)結合后得到的 BAY-CS-SeNPs 具有良好的穩定性,釋放過程持續超過 70 h,累積釋放達到 78.9%。此外, CS-SeNP 與 BAY 55-9837 綴合后,藥物的腎清除率顯著降低,且半衰期延長至 20.81 h。

2.5    環化

線性肽在治療上受到代謝和構象穩定性差等因素的限制,可能損害其生物活性并影響半衰期,而環肽可以克服這些挑戰,因為它們更能抵抗代謝降解且能被設計成所需要的構象。通過環化使多肽類藥物獲得穩定的剛性結構,是延長血漿半衰期的一種有效途徑。環化法能夠消除多肽鏈中帶電荷的末端,防止氨基酸的酶解,改善藥物代謝穩定性、膜滲透性甚至提高口服生物利用度。奧曲肽是天然生長抑素的環狀八聚體合成類似物,其保留了生長抑素的關鍵 Phe-Trp-LysThr 部分(含有色氨酸殘基),與生長抑素藥理作用相似,但作用持續時間更長,在很大程度上延長了體內消除半衰期。普卡那肽( plecanatide)是含有 16 個氨基酸的環狀多肽, 2017 年經 FDA 批準上市,商品名為Trulance,給藥方式為口服,用于治療成人慢性特發性便秘。目前,鑒于環化法的優點,此種方法已被廣泛應用于制備口服腸道多肽藥物,提高藥物的生物利用度。環狀肽還可與具有高親和力和選擇性的蛋白質靶標結合,用于診斷或治療,目前已從天然來源如細菌、真菌、植物和動物中分離出針對多種蛋白質靶標的環肽配體。

2.6 與聚合物綴合

2.6.1 PEG 化學修飾

化學修飾是蛋白多肽類藥物常用的一種長效化技術,修飾的常用方法包括 N-乙; C-酰胺化,氨基酸鏈中氨基和/或羧基末端的化學修飾可以增強敏感蛋白多肽對蛋白水解酶的穩定性。例如BAX 855[PEG-重組凝血因子Ⅷ(rFVIII)], rFVIII 經聚乙二醇修飾后,可以減少注射頻次,同時也保留了FVIII 分子的功效。 TP508 是一種合成衍生的組織修復肽,在治療糖尿病足潰瘍的Ⅰ /Ⅱ期臨床試驗中表現出較好的安全性和潛在的功效,但 TP508 體內半衰期短,研究人員嘗試將各種大小的聚乙二醇與 TP508 的N-末端或內部半胱氨酸上進行共價連接,評估后發現,PEG30k-TP508 血漿半衰期相比于 TP508 延長約 19 倍,同時還顯示出增強的生物活性。對原藥 N 端氨基進行修飾目前已被廣泛應用于多肽蛋白類藥物的商業化長效技術,例如 PEG 化粒細胞集落刺激因子(PEGG-CSF)和 PEG 化白細胞介素-10(PEG-IL-10)早在2006 年已申請美國專利,目前也已經有多種 PEG 化藥物被批準上市(見表 4)。

2.6.2 非結構化可生物降解蛋白綴合

除 PEG 外,非結構化可生物降解蛋白( XTEN)修飾也能夠延長治療性蛋白多肽的半衰期。 XTEN 是非結構化的非重復蛋白質聚合物,目標治療性分子可以與 XTEN 化學綴合,旨在通過引入類似于 PEG 的膨脹效應來延長藥物的體內半衰期。例如,研究人員將一種抗逆轉錄病毒肽 T-20(用于治療具有多藥耐藥性的 HIV-1)與 XTEN 結合,發現其消除半衰期為 (55.7± 17.7) h,幾乎是 T-20 半衰期的 20 倍。

2.6.3 PAS 綴合

開發出具有擴展的流體動力學體積的構象無序多肽鏈也是一種延長半衰期的方法,這種無序多肽鏈包含脯氨酸、丙氨酸和絲氨酸,簡稱為 PAS 無序多肽鏈。 PAS 序列是親水的、不帶電荷的生物聚合物,在水性緩沖液中形成無規則卷曲結構,其生物物理特性與 PEG 非常相似,可以通過化學偶聯與具有生物活性的蛋白質或多肽綴合,延長其血漿半衰期。此外, PAS可生物降解,避免了在器官中的積聚,在血清中較為穩定,且在小鼠體內很難產生毒性或免疫原性。 PAS 化已成功應用于多種生物制劑包括細胞因子、生長因子、抗體片段、酶以及各種多肽,其優勢在小鼠、猴等各種動物模型中均得到驗證。

2.6.4 羥乙基化淀粉綴合

阿那白滯素(Anakinra)是人IL-1 受體拮抗劑,用于治療類風濕性關節炎,但此藥半衰期較短,臨床應用上需要每天注射,極大地降低了患者的順應性,羥乙基化淀粉(HES)是一種淀粉聚合物,將 Anakinra 與 HES 綴合后,得到的復合物穩定性增加,且藥動學結果顯示其體內半衰期增加 6.5 倍,AUC 增加 65倍。

2.6    釘合肽

釘合肽是近年來新出現的一種結構肽,因其結構十分穩定而受到研究者的關注。釘合肽是將肽“釘”成α-螺旋形狀,獲得優化的交聯化學結構,通過交聯“裝訂”賦予肽對蛋白水解降解的抗性并增強其半衰期。釘合肽代表了一種有前途的新方法,可用于調節細胞內蛋白質-蛋白質或蛋白質-DNA 相互作用,并提供了瞄準細胞內靶標的機會。 LaBelle 等基于 BIM BH3 螺旋模型設計了碳氫化合物釘合肽,其可廣泛靶向 Bcl-2 家族蛋白,從而觸發促凋亡活性。 ALRN-5281 是第一個長效人生長激素釋放激素(GHRH)激動劑釘合肽藥物,自2013 年 1 月開始進入Ⅰ期臨床試驗。研究證明,碳氫化合物釘合 α-螺旋肽已成為一類新的肽治療劑,此類釘合肽具有穩定的構象,能夠提高藥物的體內生物利用度。

2.7    藥物傳遞系統開發

注射劑進入體內后起效快、體內分布迅速、生物利用度高,但面臨著患者依從性差、給藥不方便、生產成本高以及使用風險高的問題,因此,研究者也在致力于開發注射劑藥物傳遞系統(DDS),以期將藥物在一定時間內遞送到特定部位發揮療效,這種系統能夠通過制劑的手段提高藥物靶向功效、降低藥物的毒副作用。Zoladex 是已上市多肽植入劑的代表,活性成分是醋酸戈舍瑞林,用于治療前列腺癌及乳腺癌,可直接注射于皮下或肌內,與其他類型的植入劑相比,無需通過手術取出基質,聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)可自行在體內降解,從而減少了藥物不良反應。采用 PLGA 或聚乳酸(PLA)為骨架材料,包裹藥物制成注射微球,在體內也可達到緩釋的目的,并且 PLGA和 PLA 是經美國 FDA 批準的生物材料,可在體內降解。第 1 個多肽注射微球產品是曲普瑞林 PLGA 微球,由法國 Ipsen 公司開發,于 1986 年上市,可緩釋 1 個月,近年來也有多種長效化緩釋微球被批準上市(見表 5)。脂質雙層和細胞膜結構相似,因此脂質體可以有效地滲透細胞膜以釋放藥物,而且脂質體可生物降解、基本無毒,可以包封親水和疏水材料,在藥物遞送系統中用作藥物載體,體內相容性和安全性均較好。例如米伐木肽脂質體注射劑,于 2009 年上市,給藥周期為每周 2 次,治療 3 個月,隨后每周 1 次,治療 6 個月,用于治療非轉移性可切除的骨肉瘤。

3 結語

目前,越來越多的研究者將目光轉向蛋白多肽類藥物,此類藥物的研發和上市也呈現出逐步加速的趨勢,占據的市場份額也越來越大。一方面,大約 80%的蛋白多肽藥通過注射途徑給藥,另一方面,作為長效化技術手段, PEG 化和融合蛋白技術在蛋白多肽類藥物中的應用較為成熟和普遍,而隨著生物技術的發展,開發其他劑型及給藥途徑也日益受到關注,如 DDS。Midasol Therapeutics 公司利用胰島素糖基化納米粒子開發的經口腔遞送系統,以及 ActoGeniX 公司開發的TopAct 技術平臺,以期用口服給藥替代注射給藥途徑。研究人員開發了各類藥物傳遞系統,目的是通過載體控制藥物的釋放、提高藥物的穩定性,另外還能提高難溶藥物的溶解性、靶向性。目前開發的 DDS 主要有植入劑、微球注射劑、脂質體注射劑、納米粒注射劑等,預示著未來緩釋、控釋和納米制劑等有非常好的前景?梢韵嘈,未來人們還會不斷尋求新的長效化手段,研發出活性更好且更加長效的蛋白多肽類藥物,為現有長效技術錦上添花,為廣大患者造福。

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